摘要：本试验分别用0、15%、30%、45%、60%的生物饲料酵母替代饲料中0、17%、34%、51%、68%的鱼粉，配制五种等氮、等能的试验饲料,分别表示为Ⅰ组（对照组）、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组和Ⅴ组。饲养大菱鲆56d后，研究生物饲料酵母替代鱼粉后对大菱鲆生长及免疫机能的影响。结果表明，随饲料酵母替代比例的增加，增重率（WGR）和特定生长率（SGR）没有显著差异（P＞0.05），蛋白质效率（PER）、肝体指数（HSI）和内脏指数（VSI）均逐渐降低（P＜0.05），饲料系数（FCR）逐渐增高（P＜0.05），Ⅱ组和Ⅳ组的成活率（SR）均显著高于对照组（P＜0.05），而Ⅴ组显著低于对照组（P＜0.05）。Ⅱ组和Ⅴ组的肥满度(CF)与对照组没有显著差异（P＞0.05），Ⅲ组和Ⅳ组分别显著高于对照组15.7%和15.7%（P＜0.05）。鱼体的水分和脂肪随着替代比例的增加没有发生显著的变化（P＞0.05），而粗蛋白含量逐渐降低（P＜0.05），粗灰分则逐渐升高（P＜0.05）。血清中的溶菌酶、超氧化物歧化酶活性和血清中蛋白的含量也随着替代比例的增加而减少，杀菌活性没有显著的差异（P＞0.05），而碱性磷酸酶活性则出现先升高后降低的趋势（P＞0.05）。实验结果显示，饲料中较高比例的生物饲料酵母替代鱼粉会降低大菱鲆的生长性能，并干扰其脂肪和蛋白质的代谢。综合考虑大菱鲆的生长指标、形体指标、鱼体成分和免疫机能等因素，要获得最佳的养殖效益，牙鲆饲料中的添加量以17%为宜。

　　关键词：大菱鲆；生物饲料酵母；生长性能；免疫机能

　　前言

　　众所周知，在水产动物的饲料原料中，最紧缺的就是饲料蛋白源，积极开发饲料蛋白源具有很高的经济和社会效益。目前对渔用蛋白源的研究及开发利用主要集中在动物性蛋白源、植物性蛋白源、单细胞蛋白源等几个方面。饲料酵母（feed yeast）[1-2]属单细胞蛋白，是用酒精废液、味精废液、亚硫酸纸浆废液、石蜡油或糖蜜等作原料，以热带假丝酵母（Candida tropicalis）、产朊假丝酵母（Candida utilis）为菌种，在发酵罐内经培养繁殖而获得的菌体浓缩物。蛋白质含量45%～60%[3]，氨基酸种类齐全，富含B族维生素，还有丰富的酶系和多种活性物质，如：辅酶A、辅酶Q、细胞色素C、凝血质、谷胱甘肽、卵磷脂、麦角固醇和核糖核酸等。本试验所使用的饲料酵母是以淀粉企业生产淀粉和葡萄糖的副产物为底物，以产朊假丝酵母（Candida utilis）为菌种，经过一系列的发酵、蒸干、喷雾干燥等工艺加工而成。该饲料酵母蛋白质含量可达46%，细胞总数约为160亿/g，粗脂肪为3%，核酸为8%，赖氨酸含量较高，蛋氨酸含量较少，营养十分丰富。如能充分利用该饲料酵母作为蛋白源最大限度的替代鱼粉，不仅可以减少鱼粉的使用，降低生产成本；还能充分利用我国玉米深加工的副产物资源，解决资源再利用的问题。

　　目前，关于饲料酵母对鱼类的影响已经在多种鱼类上进行了相关的研究，研究的内容多集中在饲料酵母替代鱼粉后对鱼类的生长、饲料利用等[3-7]的研究。研究的对象多集中在鲤鱼(Cyprinus carpio) [4]、建鲤(Cyprinus carpiovar jian)[5]、罗非鱼（Tilapia）[7]、淡水白鯧（Freshwater orbfish）[8]上，对大菱鲆的研究还很少。大菱鲆（Scophthatmus maximus）英文名Turbot，在中国俗称为“多宝鱼”，是一种底栖的肉食性鱼类，它易于被驯服、生长速度快、肉质细嫩、口感独特，是我省乃至我国重点养殖品种，也是养殖产量较大的品种之一。大菱鲆对蛋白质营养的需求量很高，蛋白含量低于39%时，幼鱼增长缓慢，只有蛋白含量高于42%时，大菱鲆幼鱼才会快速增长[9]。

　　因此，针对大菱鲆研究饲料酵母在其饲料中的应用，具有典型的代表作用。本研究通过营养学和免疫学方法探索生物饲料酵母替代鱼粉的可行性及其在大菱鲆饲料中适宜的添加比例，为生物饲料酵母的应用提供参考。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验饲料的配制

　　试验所用鱼粉为粗蛋白为68%的秘鲁鱼粉，生物饲料酵母由秦皇岛骊骅淀粉股份有限公司生产、提供，粗蛋白含量为48.3%，按照不同的替代比例设计5种不同的饲料配方，Ⅰ组为对照组，不添加饲料酵母，Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组分别含有15%、30%、45%和60%的饲料酵母，相应替代17%、34%、51%和68%的鱼粉。饲料配方及饲料常规成分见表1。根据饲料配方将所有饲料原料用粉碎机进行粉碎过80目筛、混匀,用F-26型双螺杆挤条机（华南理工大学科技实业总厂制造）制成1.5mm的硬颗粒饲料, 70℃干燥后装袋密封后于-20℃冰箱保存,备用。

　　注：其它（%）：磷虾粉,2；玉米淀粉，5;复合矿物盐，0.5；复合维生素，2；胆碱，0.5；Vc磷酸酯，0.4；CMC，1; Y2O3,0.01.

　　复合矿物盐(g/Kg)：氯化钴，0.04；硫酸铜，2.5；硫酸亚铁，40；硫酸镁，283.98；硫酸锰，6.5；碘化钾，0.67；亚硒酸钠，0.1；硫酸锌，131.93；填充物，534.28；

　　复合维生素(g/Kg)：盐酸硫氨素，0.5；核黄素，3；VB6，1；烟酸，5；肌醇，5；泛酸钙，5；生物素，0.05；叶酸，0.18；VK3，2；VB12，0.002；VA醋酸盐(20,000IU/g)，5；VD3，(400,000IU/g)，0.002；VE，(250IU/g)，8；纤维素，865.266.

　　1.2 试验设计及饲养管理

　　大菱鲆幼鱼购于秦皇岛天合水产良种有限公司，平均体重为（9.02±0.15g）、平均体长为（6.10±0.06cm），采用单因素完全随机分组设计, 200尾大菱鲆幼鱼,随机分为 5 个组,每组 3 个重复,每个重复放养13尾鱼。饲养于室内循环流水的水族箱（120L）中 , 以试验饲料驯化10d，待鱼适应后，开始试验。保持微流水状态,水温（18 .0±1.0）℃, pH（7.6±0.4），溶氧大于8 mg /L，盐度为（30.60±0.02）。每天饲喂 3次（7:00、12:00和18:00）,投饲率为体重的3 %~ 4% ,每 14 d调整投喂量。试验持续56d。

　　1.3 样品采集与分析

　　试验结束后,禁食1d称重,每箱随机取3尾鱼再次称重后,于105℃ 烘干(A.O.A.C.)[10],用微型粉碎机粉碎、称重,装入密封袋中于-20℃冰箱中冷冻保存,用于全鱼粗蛋白、粗灰分和粗脂肪含量[11-12]的分析。另随机从每箱随机取3尾鱼,麻醉处理后,测体长和体重,然后用2.5mL一次性无菌注射器（含肝素钠）从心脏采血,置于4℃冰箱过夜,以3000r/min于4℃下离心10min,分离血浆,收集的血浆保存于-80℃冰箱待测。

　　1.3.1 体成分的测定

　　饲料及鱼体成分均采用国标法进行测定：干物质采用105℃烘箱干燥法；灰分采用马弗炉灼烧法（550℃）；粗蛋白质采用凯氏定氮法;粗脂肪采用索氏抽提法(以石油醚为溶剂)[13] 。

　　1.3.2 生化指标的测定

　　血清中的总蛋白采用考马斯亮蓝染色法，超氧化物歧化酶（SOD）活力的测定采用黄嘌呤氧化酶法，碱性磷酸酶（AKP）测定采用磷酸苯二钠比色法，以上指标均用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。溶菌酶活性的测定是将溶壁微球菌溶于0.02M醋酸缓冲液制成0.025%w/v的菌悬液，将溶菌酶标准样用0.02M醋酸缓冲液稀释成0、2、4、6、8、10μg/ml等不同浓度的稀释液，各取15μl分别加入250μl菌悬液，在0min读取450nm处吸光值A0，37℃孵育20min后，再次读取450nm处的吸光值A，以溶菌酶稀释液为横坐标，以（A0 –A）为纵坐标绘制出标准曲线，血清的测定方法与标准曲线一致，将15μl血清样本加入250μl菌悬液，测其(A0-A)，在标准曲线上找出其相应的溶菌酶浓度。杀菌活性的测定采用大肠杆菌为底物，在普通培养基中培养24h后，用1/15M pH=6.4 PBS洗涤成菌悬液，使其OD570≈0.3。取2ml配置好的大肠杆菌菌悬液放入试管中，加入20μl血清混匀，测其A0，然后将试管移入37℃水浴30min取出后立即冰浴10min，测其A。则UL=[(A0-A）/ A0]1/2。

　　1.4 数据处理

　　试验结果用平均数±标准误（mean±SE）表示, 采用SPSS（17.0）统计软件对数据进行统计学分析,先对数据作单因素方差分析(One-way ANOVA) ,若组间差异显著,再用Duncan’s法进行多重比较,显著水平为 0.05。

　　2 结果

　　2.1 不同比例的生物饲料酵母替代鱼粉对大菱鲆生长性能的影响

　　由表2可见，生物饲料酵母替代鱼粉的比例在68%以下时，对照组和试验组的增重率（WGR）和特定生长率（SGR）均无显著差异（P＞0.05），但是Ⅱ组WGR和SGR均显著高于Ⅲ组、Ⅳ组和Ⅴ组（P＜0.05），Ⅲ组、Ⅳ组和Ⅴ组之间并无明显差异（P＞0.05）。对照组的饲料系数（FCR）和蛋白质效率（PER）与Ⅱ组和Ⅲ组的组间差异不显著，与Ⅴ组差异显著（P＜0.05）。Ⅱ组和Ⅳ组的SR均显著高于对照组（P＜0.05），而Ⅴ组显著低于对照组12.1%（P＜0.05）。结果表明，饲料中用饲料酵母替代鱼粉17%~51%时，对大菱鲆的生长性能没有显著性的影响，但是51%替代时，虽SR与17%替代组相差不大（P＞0.05），但WGR、SGR和PER显著低于17%替代组，。34%替代时，虽然WGR、SGR、FCR和PER都和对照组差别不大，但其SR却远远低于17%替代组。

　　注：增重率(WGR， %) = 100 ×(末体质量 - 初体质量) /初体质量;特定生长率 (SGR， %/ d) = 100 ×( l n 终末体重 -l n 初始体重) /试验天数;成活率（SR ，%）=(试验结束鱼尾数/试验开始鱼尾数)×100;饲料系数（FCR） =摄食饲料总量/鱼体增重量;蛋白质效率（PER） =鱼体增重量/蛋白质摄取量;

　　2.2 不同比例的生物饲料酵母替代鱼粉对大菱鲆形体指标的影响

　　由表3发现，随着饲料酵母替代鱼粉比例的增加，肝体指数（HSI）和内脏指数（VSI）均逐渐下降，Ⅱ组与Ⅲ组的HSI分别显著高于对照组45.4%和38.1%（P＜0.05），Ⅳ组与对照组没有显著差异（P＞0.05），而Ⅴ组的HS I显著低于对照组69.2%（P＜0.05）。Ⅱ组的VSI显著高于对照组24.6%（P＜0.05）, Ⅲ组和Ⅳ组的VSI与对照组差异不明显（P＞0.05），而Ⅴ组显著低于对照组3.7%（P＜0.05）。Ⅱ组和Ⅴ组的CF与对照组没有显著差异（P＞0.05），Ⅲ组和Ⅳ组分别显著高于对照组15.7%和13.4%（P＜0.05）

　　2.3 不同比例的生物饲料酵母替代鱼粉对大菱鲆体成分的影响

　　由表4可知，全鱼水分的含量随着替代比例的增加没有显著性差异（P＞0.05），但Ⅱ组的水分含量最低；随着生物饲料酵母替代鱼粉的比例的不断增加，粗蛋白的含量产生了显著的差异，Ⅲ组与对照组差异不显著（P＞0.05），Ⅱ组显著高于对照组（P＜0.05），Ⅳ组和Ⅴ组显著低于对照组（P＜0.05）。粗脂肪的含量Ⅳ组最高，Ⅲ组次之，Ⅱ组最低，但各组间差异不明显（P＞0.05）。Ⅳ组和Ⅴ组的灰分含量差异不明显，其他各组差异显著（P＜0.05），Ⅰ组、Ⅲ组、Ⅳ组和Ⅴ组分别显著高于Ⅱ组29.10%，45.60%，57.53%和58.72%。

　　2.4 不同比例的生物饲料酵母替代鱼粉对大菱鲆免疫机能的影响

　　由表5可以看出，Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组的溶菌酶的活性与Ⅳ组、Ⅴ组的差异显著（P＜0.05），但Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组之间、Ⅳ组和Ⅴ组之间均无显著性的差异（P＞0.05）。随着替代比例的增加，杀菌活性差异不明显（P＞0.05）。AKP活性出现先升高后降低的趋势，Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组无显著性差异，但Ⅲ组与Ⅳ组、Ⅴ组差异显著。SOD呈现逐渐降低的趋势，血清中的蛋白含量Ⅱ组最高，其他组逐渐降低。

　　注：100ml血清在37℃与基准作用15min产生1mg酚为1个金氏单位。

　　3 讨论

　　本试验中，饲料中添加17%的生物饲料酵母时，大菱鲆的生长性能最佳，这与张梁[7]网箱养殖淡水白鯧的结果相同。诸多研究表明[14-17]，饲料酵母部分或全部替代鱼粉应用在水产动物上是可行的，但是要根据养殖种类和鱼类食性的差异，调整饲料配方，满足鱼类营养的需要。

　　生物饲料酵母替代鱼粉应用在大菱鲆的饲料中，结果表明，随生物饲料酵母替代鱼粉比例的增加，大菱鲆的增重率（WGR）、特定生长率（SGR）和蛋白质效率（PER）随之下降，表明高比例的饲料酵母不利于大菱鲆的生长，可能是试验对象为幼鱼，需要较多的能量来满足鱼体的生长，当饲料酵母增多时，幼鱼难于消化，饲料中可消化能减少的缘故。但葛树立[7]用活性酵母养殖罗非鱼时，随着替代比例的增加，WGR增加，FCR降低，表明活性酵母明显促进罗飞鱼(Tilapia)的生长。这可能与养殖品种、酵母的来源、组成等有关。较高的饲料酵母替代鱼粉也同样降低了鲤鱼[4] 、淡水白鯧[8]、胡子鲶[18]的摄食和生长，也可能是高浓度的饲料酵母引起鱼体的免疫反应过度，导致用于生长的能量和营养素减少。Rumsey等[19 ]则认为完整的酵母细胞无法使胞内的营养成分释放出来而被鱼类利用是高含量酵母能力较差的原因。

　　幼鱼的消化系统发育不及成鱼完善，对各种环境因子尤其是食物因子的变化反应比较敏感，当饲料中大量添加生物饲料酵母时，可能会对消化系统的发育产生一定的影响，肝体指数（HSI）和内脏指数（VSI）等会发生较大变化。在本试验中，Ⅱ组和Ⅲ组的HIS、VSI和CF均高于对照组，说明一定比例的饲料酵母会刺激鱼体形体的生长，改善肝功能，但黄钧[6]用加酶饲料酵母替代鱼粉饲养丰鲤时，鱼粉组的CF显著高于各饲料酵母替代组。

　　本试验结果表明，随生物饲料酵母替代鱼粉比例的增加，水分和脂肪含量无明显变化，粗蛋白含量逐渐降低，而灰分的含量逐渐升高。而程光平[17]用酵母蛋白替代鱼粉饲养胡子鲶，测定其水分、粗蛋白、粗灰分和氨基酸总量时，与鱼粉组均没有差异。当饲料酵母替代鱼粉超过51%时，粗蛋白的含量显著下降，表明高比例的生物饲料酵母替代鱼粉会影响蛋白质在鱼体内的沉积，这与高含量饲料酵母组的饲料利用率较低有关。从总体来看，Ⅱ组的粗蛋白含量最高，显著高于对照组，而其粗脂肪含量又最低，说明饲料中添加17%的生物饲料酵母能够增加鱼的蛋白含量，减少脂肪的堆积，能显著提高鱼肉的品质，使鱼肉更加鲜嫩可口。

　　溶菌酶广泛存在于动物体内的许多组织和体液中，是能否杀灭病原菌的物质基础，血清中的溶酶菌主要来自血细胞中，是一种碱性球蛋白，能够专一性地水解肽多糖分子中β-1,4糖苷键，从而破坏并裂解细胞壁，最终使细菌死亡，实现其机体防御的功能[20-21]。测定鱼体的溶菌酶活性，可以一定程度上反映鱼类非特异性体液免疫状态。在本试验中，溶菌酶的活性在添加17%生物饲料酵母时最高，增加饲料酵母的添加量，溶菌酶活性反而降低，说明高浓度的生物饲料酵母对溶菌酶的活性可能具有抑制作用。

　　超氧化物歧化酶具有催化超氧离子自由基进行歧化反应的功能，是机体清除氧自由基的重要抗氧化保护酶，它能促使自由基的形成和使清除处于动态平衡，从而清除自由基对机体的危害，保护细胞免受损伤。当 SOD活性降低时，其自由基等毒害物质就会积累。在本试验中，血清中的蛋白含量和超氧化物岐化酶（SOD）也都随着饲料酵母添加比例的增加而减少，说明添加高比例的饲料酵母可以减弱机体的免疫能力，这可能也是导致高替代组死亡率增加的重要原因之一。

　　综上所述，由饲料酵母替代饲料中17%左右的鱼粉可以使大菱鲆的生长、成活率、机体营养成分和免疫机能优于其他各组。